Knock Out, Knock In, Knock Down – Genetycznie manipulowane myszy i Nagroda Nobla ad

Był w stanie uratować genetycznie uszkodzone zmutowane komórki poprzez wprowadzenie funkcjonalnej kopii genu do ich DNA Prace Smithiesa i Capecchi nad hodowanymi komórkami somatycznymi pobudziły rasę do wprowadzenia zmian genetycznych w linii zarodkowej zwierzęcia. Korygowanie defektu genetycznego w sposób zapewniający odziedziczalność korekcji wymagałoby jednak linii komórkowych, które przyczyniają się do tworzenia komórek płciowych. Oba zespoły zwróciły się do pracy Martina Evansa, który scharakteryzował linie komórkowe zarodkowych komórek nowotworowych, które powstały z gruczolakoraków trzustki myszy. Te linie komórkowe można indukować w celu różnicowania na wiele typów tkanek, co wskazuje na ich potencjał zachowania podobnego do komórek macierzystych. Evans wstrzyknął hodowane zarodkowe komórki raka do mysich blastocyst, które następnie wszczepiono matce zastępczej. Wynikiem była linia chimerycznych myszy zawierających tkankę pochodzącą z hodowanych komórek nowotworowych. Ale komórki te zostały wyprowadzone z genomicznie niestabilnego guza, więc Evans i jego koledzy następnie rozwinęli linię pluripotentnych komórek macierzystych z blastocystami myszy.3 Poprzez wstrzyknięcie blastocyst z hodowanymi zarodkowymi komórkami macierzystymi, które zostały zainfekowane retrowirusami, wytworzyły one chimeryczne myszy, w których retrowirusowe DNA było wykrywalne zarówno w komórkach somatycznych, jak i linii płciowej. Następnie Evans użył inżynierii genetycznej do stworzenia mysiego modelu choroby ludzkiej: fenotyp molekularny zespołu Lesch-Nyhana został podsumowany przez wstrzyknięcie blastocyst zarodkowymi komórkami macierzystymi z retrowirusami, które inaktywowały mysi gen fosforybozylotransferazy mysiej (hprt).
Evans, Smithies i Capecchi szybko starali się naprawić zmutowane geny w embrionalnych komórkach macierzystych. Smithies i Capecchi skupili się na korygowaniu defektów genu hprt w takich komórkach, identyfikując i selekcjonując komórki, które przeszły homologiczną rekombinację, eliminując w ten sposób zmutowany gen. 4,5 Ta praca, w której celowanie genów zostało osiągnięte przez rekombinację homologiczną, doprowadziła do opracowanie ogólnej metody, dzięki której można zinaktywować specyficzny gen w embrionalnej komórce macierzystej; genetycznie zmieniona komórka, po wszczepieniu w zastępczą matkę, ostatecznie daje początek szczepowi myszy, który jest homozygotyczny pod względem obojętnego genu – myszy nokautującej . Technika ta została wykorzystana do wygenerowania tysięcy różnych rodzajów myszy z nokautem o cechach szczególnych chorób ludzkich. Co ważniejsze, transformacja naszego rozumienia funkcji genów: zamiast polegać na spontanicznych mutacjach w celu wywnioskowania funkcji genów, możemy teraz użyć eksperymentalnie ukierunkowanych mutacji do testowania funkcjonalnej roli genu prospektywnie.
Knockout i Knock-in Myszy. Wektor ukierunkowany na geny (lewy panel) skonstruowano w celu usunięcia specyficznego eksonu genu w embrionalnych komórkach macierzystych. Kilka kilopaz DNA po każdej stronie docelowego genu jest klonowane wokół markera selekcji leku. Po wprowadzeniu sklonowanego DNA (wektora docelowego) do komórek macierzystych, w hodowli następuje dodatnia i ujemna selekcja leku. Lewy panel pokazuje wektor kierujący, który skonstruowano z sekwencjami loxP flankującymi pozytywny gen selekcji lekowej. Cre rekombinazy może usuwać sekwencję DNA pomiędzy miejscami loxP, tym samym usuwając specyficzny gen w embrionalnych komórkach macierzystych
[patrz też: ciśnieniomierz allegro, mezoterapia igłowa przeciwwskazania, półpasiec u dzieci zdjęcia ]