Knock Out, Knock In, Knock Down – Genetycznie manipulowane myszy i Nagroda Nobla cd

Myszy typu knock-in (prawy panel) są generowane przez zastąpienie egzogennego egzonu jednym z niosącym interesującą mutację. Strategia nakierowania genów jest podobna do strategii stosowanej dla myszy z nokautem, z wyjątkiem tego, że ekson zastępczy (oznaczony gwiazdką) jest wymieniany z egzonem endogennym. Strategie Cre-loxP mogą usuwać większość śladów wektora kierowania. Po wybraniu pożądanego klonu komórek macierzystych wstrzykuje się go do blastocysty, który wszczepia się do macicy przybranej matki. Jeżeli ukierunkowane na geny komórki macierzyste przyczyniają się do rozwoju komórek rozrodczych u chimerycznych myszy, kolejne potomstwo będzie zawierać mutację genetyczną (transmisja zarodkowa). Początkowo myszy z nokautem były wytwarzane przez zastąpienie lub przerwanie egzonów kodujących genu znacznikiem selekcji leku. Takie myszy można by wykorzystać do badania jedynie skutków utraty genu, a nie określonej mutacji. W tym ostatnim celu opracowano metodę knock-in , w której zmutowaną sekwencję DNA wymienia się na sekwencję endogenną bez żadnego innego zakłócenia tego genu. Niektóre strategie knock-in polegają na użyciu wektorów genowych z sekwencjami flankującymi, określanymi jako loxP, które po ekspozycji na enzym zwany rekombinazą Cre przechodzą rekombinację wzajemną, prowadząc do delecji interweniującego DNA. Za pomocą tej metody można zastąpić sekwencję genów sekwencją wybranego badacza i usunąć niepotrzebne sekwencje (patrz diagram). Gen rekombinazy Cre został znokautowany w docelowe loci w sposób, który zapewnia ekspresję pod kierunkiem endogennego promotora genu, umożliwiając w ten sposób specyficzną tkankowo lub czasowo ekspresję enzymu Cre, a zatem rekombinację miejsc loxP, które otaczają interesujący gen. Zastosowania tej metody są liczne, a niektóre z nich są już użyteczne klinicznie. Na przykład, wbijanie segmentów genu ludzkiej immunoglobuliny do genomu myszy umożliwia myszy wytwarzanie terapeutycznie użytecznych humanizowanych przeciwciał. W miarę ewolucji technologii i strategii ukierunkowanych na geny, możliwe staje się tworzenie mysich modeli poligenicznych chorób u ludzi, takich jak cukrzyca i nadciśnienie.
Biorąc pod uwagę powodzenie celowania genowego u myszy, rozsądne jest wyobrazić sobie zastosowanie kliniczne podobnej strategii. W zasadzie powinno być możliwe genetyczna modyfikacja komórek macierzystych w celu przywrócenia funkcji wyłączonego genu w określonych tkankach. Istnieje potencjał, na przykład, do korygowania zmutowanego wspólnego genu łańcucha gamma w hematopoetycznych komórkach macierzystych pacjentów z ciężkim złożonym niedoborem odporności połączonym przez X w celu przywrócenia rozwoju limfocytów.
Czy w komórkach macierzystych można zastosować inne techniki modyfikacji genów. Zeszłoroczna Nagroda Nobla została przyznana za odkrycie interferencji RNA, w której geny są wyciszane lub powalane przez krótkie fragmenty dwuniciowego RNA. Odkrycie to rozszerzyło naszą koncepcję dziedzicznych regulatorów ekspresji genów o cząsteczkę RNA. Obecnie możliwe jest wykorzystanie wektorów wirusowych do wstawiania interferującego RNA do komórek macierzystych w celu odtworzenia lub innej modyfikacji aktywności genów w wybranych tkankach. Te i inne metody przyspieszają tempo rozwoju klinicznych zastosowań celowanej terapii genowej, której potencjał został ujawniony przez tegorocznych laureatów Nagrody Nobla.
Finansowanie i ujawnianie informacji
Wywiad z dr Susan Dymecki, profesor nadzwyczajny genetyki w Harvard Medical School, można usłyszeć na www.nejm.org.
Author Affiliations
Dr Manis jest adiunktem w Wydziale Patologii, Harvard Medical School, a także badaczem w Katedrze Medycyny Laboratoryjnej i Wspólnym Programem Transfuzjologii w Szpitalu Dziecięcym – oba w Bostonie.

[podobne: szarłat spożywczy, ile kosztują badania medycyny pracy, fizykoterapia szczecin ]