Zakażenie pracownika laboratorium za pomocą wirusa Simian Immunodeficiency Virus ad

PBMC i oczyszczone limfocyty T CD4 + hodowano następnie w pożywce RPMI-1640 (GIBCO, Grand Island, NY) zawierającej 10% surowicy płodowej cielęcej i 1% antybiotyków i stymulowano fitohemaglutyniną przez trzy dni. Komórki następnie hodowano osobno lub z normalnymi aktywowanymi przez fitohemaglutyninę PBMC człowieka lub rezusa w obecności 10% oczyszczonej interleukiny-2. Supernatanty z hodowli usuwano co trzy do czterech dni i analizowano pod kątem aktywności odwrotnej transkryptazy zależnej od magnezu (20 mM), zgodnie z modyfikacją metody Willey i wsp., 15 i antygenu SIV p27 gag (Coulter, Hialeah). , Fla.). Fragment o długim końcu replik (127 do 167 par zasad [bp]) prowirusowego DNA został zamplifikowany z hodowanych komórek zakażonych SIV i HIV-2. Amplifikację reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) przeprowadzono w warunkach wcześniej opisanych14 z konsensusowymi primerami SIV i HIV-2 (pozycje od 300 do 328 i od 402 do 427, odpowiednio, na podstawie analizy SIVSMMH4). Podwójne próbki powielonego produktu poddano elektroforezie, a następnie hybrydyzację metodą Southern blot z dwiema wewnętrznymi sondami znakowanymi końcowo 32P.
Pierwszy blot hybrydyzowano z sondami SIV i HIV-2 zlokalizowanymi na końcu 5 sekwencji delecyjnej charakterystycznej dla izolatów SIV (pozycja 354 do 373, na podstawie sekwencji SIVSMMH4 i pozycji 356 do 376, na podstawie sekwencji HIV-2BEN). Drugi blot hybrydyzowano z sondą swoistą dla HIV-2 (pozycja 380 do 410, na podstawie sekwencji HIV-2BEN) pochodzącą z sekwencji 40 do 44 pz, która nie występuje w wirusowych izolatach SIVSMM i SIVMAC 13 16,17.
Fragment env amplifikowano ze starterami zaprojektowanymi z konsensusowych sekwencji HIV-2 i SIVSMM i SIVMAC, które obejmują region V1 i połowę regionu V2. Fragment ten wykazuje wysoki poziom zmienności sekwencji między tkankami i przełyku, jak wcześniej podano16 (pozycje użytych par starterów były 6857 do 6884 i 7135 do 7164 i były oparte na sekwencji SIVMAC251). Powielony produkt następnie zsekwencjonowano i sekwencję porównano z sekwencją innych izolatów SIV. W celu ułatwienia klonowania i sekwencjonowania produktu otoczki 2 mikrolitry podstawowej próbki amplifikacji poddano nested PCR, z wewnętrznymi starterami (pozycje 6885 do 6908 i 7135 do 7164, na podstawie analizy SIVMAC251). Produkt sklonowano w wektor niebieski pT7 (Novagen, Madison, Wis.) Zgodnie z instrukcjami producenta. Dwuniciowe plazmidowe DNA następnie sekwencjonowano za pomocą metody zakończenia łańcucha dideoksy za pomocą zestawu Sequenase wersja 2.0 (US Biochemical, Cleveland).
PCR wykonywano również co miesiąc od kwietnia 1992 r. Do maja 1993 r. Na 150 000 do 450 000 nie hodowanych PBMC z podstawowymi primerami i sondami SIV SIV, a proces powtórzono dla swoistych dla SIVHU starterów i sond env w warunkach opisanych wcześniej14. Zamplifikowane fragmenty env uzyskane w kwietniu 1992 i październiku 1992 zostały zsekwencjonowane, a ich sekwencje porównano z sekwencjami innych izolatów SIV, jak opisano powyżej.
W sierpniu 1992 r. 10 ml krwi traktowanej heparyną zostało zaszczepione w ciągu 24 godzin od pobrania do małpy rezus i makaka z wąsami
[przypisy: jak oddać krew, wybielanie zębów przed i po, sildenafil bez recepty ]